单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现出不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体。这些电荷异构体的形成可能发生在产品的整个生命周期的任何阶段。电荷异构体宏观表现为等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰（图1）。电荷异构体的产生原因主要包括C-末端赖氨酸截除，N-PG电子平台网站末端谷氨酰胺/谷氨酸环化作用，N糖基化，氧化，半胱氨酸残基，分子片段和多聚集引起的异质性等(图2)。不同原因产生的电荷异构体所带来的电荷性质的变化、对单抗生物活性的影响以及相应的控制策略均不相同。

　　在上游细胞培养过程中，随着培养时间的延长，抗体的浓度逐渐升高；与此同时，酸性电荷异构体的比例也逐渐升高（图3）。因此我们需要在抗体上游培养的浓度和下游的回收率之间进行平衡，来确保抗体产品的质量（图4）。

　　2014年10月上市的Capto S ImpAct 阳离子层析填料，兼具高载量，高流速，高分辨率的特点，在单抗酸性电荷异构体的分离方面，也有不错的表现。当采用盐浓度洗脱方式时，可以和40um粒径的Capto SP ImpRes填料表现出相同的分离效果，在酸性电荷异构体去除率达到50%时，达到近80%的回收率（图5）；考虑到Capto SImpAct填料在结合载量上约100 mg/ml的杰出表现（图6），使其成为更优的选择。

　　置换层析（displacement chromatography）作为一种非线性色谱技术，是指样品进入色谱柱后，用一种与固定相作用力极强的置换剂（displacer）通入色谱柱，去替代结合在固定相表面的溶质分子。样品在置换剂的推动下沿色谱柱前进，使样品中各组分按作用力强弱的次序，形成一系列前后相邻的谱带，并在置换剂的推动下流出色谱柱。

　　当使用Capto S ImpAct进行单抗的电荷异构体分离时，可以利用置换色谱的思路，只要优化出合适的缓冲液电导和pH值，并且过载上样，就可以使酸性的电荷异构体成分直接在上样的阶段流穿而去除。图7则显示了这一策略的层析趋势。

　　在过载上样的情况下，最先从层析柱中流穿的全是PG电子平台网站酸性电荷异构体，随着上样量的进一步增大，才逐渐由主峰从柱子中流穿。由此我们可以推测，如果对上样条件进行优化，则可能通过这种策略有效去除酸性电荷异构体。所以，以上样量（Load）和上样pH值（pH）为Factor，回收率（Recovery）和酸性峰去除率（Clearance）为Responses，采用ÄKTA Avant中的DoE工具，进行优化实验。图8显示了上样量和上样pH值对Capto S ImpAct纯化的回收率和酸性电荷异构体去除效果的影响，并利用ÄKTA Avant DoE工具中的sweet spot分析给出了回收率大于70%，并且酸性峰去除率大于50%的工艺空间范围。考虑到工艺的稳健性，利用蒙特卡洛模拟，对工艺空间进行了预测分析。结果显示，可以获得回收率大于80%，并且酸性峰去除率大于50%的较稳健工艺空间，上样量可高达145g/L（图9）。从这个例子可以看出，使用置换色谱新思路，采用过载上样的模式，优化出合适的上样条件，即可以在极大的上样载量情况下，获得很好的电荷异构体分离效果。该方法不仅适用于经典的阳离子层析，也适用于多模式层析，具有载量高，操作简便，分离效果好等优点。

　　图8 Capto S ImpAct填料，上样量和上样pH值对回收率和酸性电荷异构体去除的影响

　　图9 蒙特卡洛模拟分析Capto S ImpAct置换色谱模式分离酸性电荷异构体的工艺空间

　　随着多模式填料的发展，多模式交换层析填料表现出与传统的阳离子交换不同的选择性，也为电荷异构体的去除打开了更广阔的探索空间。由于多模式交换填料在离子相互作用的基础上，又进一步加入了氢键、疏水等多种作用力模式，因此其层析行为相比传统的单一作用模式的离子交换填料更加难以预测，通常需要借助高通量筛选的实验方式结合实验设计的工具，获得合适的实验条件。

　　GE公司的两款高分辨率多模式填料Capto MMC ImpRes和Capto Adhere ImpRes，是平均粒径40um 的高分辨率多模式层析填料，Capto MMC ImpRes配基结构中含有羧甲基弱阳离子基团以及疏水作用的苯基（图10） ；Capto Adhere ImpRes 的配基结构中也含有可发挥疏水作用的苯基基团，与Capto MMC ImpRes 不同的是，它的配基中含有季胺基团，提示了Capto Adhere Impres 具有强阴离子层析的功能（图10）。

　　首选，使用96孔的Predictor板，快速筛选抗体在Capto MMC ImpRes填料和Capto Adhere ImpRes填料上的结合条件（图11）。然后分别采用pH线性梯度洗脱策略，进行电荷异构体的分离。

　　实验结果显示，对于Capto MMC ImpRes填料来说，缓冲液中加入50mM NaCl，采用pH5-9的梯度洗脱是较优的洗脱条件，在该条件下，抗体的电荷主峰以及酸碱性异构体的分布如图12所示。

　　图12 Capto MMC ImpRes在优化的pH梯度洗脱条件下对单抗电荷异构体的分离效果

　　当使用Capto Adhere ImpRes进行电荷异构体分离时，选择相同的pH梯度洗脱策略，结果表明，在缓冲液中无NaCl的条件下，进行pH7.5-pH4.5的连续线性梯度洗脱，洗脱峰的部分收集组分检测结果显示，收集组分A主要是单抗主峰成分，回收率为65%，组分B则含有酸性电荷异构体，收集组分C含有聚集体（图13A），同时，在该洗脱条件下，抗体的电荷主峰以及酸碱性异构体的分布则如图13B所示。

　　综上所述， 在单抗电荷异构体的去除中，可以尝试用Capto S ImpAct进行置换层析，或选择多模式填料的PH洗脱策略。如果您对电荷异构体的去除很感兴趣，欢迎联系GE当地技术支持或销售。返回搜狐，查看更多