电荷变体，尤其是酸性电荷变体，由于其对抗体稳定性和生物学活性的潜在影响，是重组单克隆抗体生产过程中的关键质量属性之一。其中，全面了解酸性电荷变体的化学性质对于工艺开发和优化有重要作用。为了完整探究酸性电荷变体的多种来源，本文首先分离并收集IgG1单抗（抗IgE单抗）的主要电荷变体， 然后采用多种表征方法进行分析，包括还原后抗体的LC-MS分子量分析、非还原性CEPG电子官方网-SDS检测、分子筛色谱、肽图分析、竞争ELISA、Biacore分析等。其中酸性电荷异构体和半乳糖基化水平之间的关系通过利用β1,4半乳糖苷酶降解后经过弱阳离子交换色谱检测进行进一步解析。最终，为了进一步了解不同电荷变体对单抗和IgE / FcRn的结合力的影响，分别通过竞争性ELISA和表面等离子体共振的方法进行分析。

　　单克隆抗体（mAb）：动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

　　电荷异构体：由于单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。

　　图1mAb的CEX色谱图，包括原始抗体（starting materials）、收集后的酸性变体（AP）、收集后的主峰（MP）和收集后的碱性变体（BP）。

　　图2N端糖基化分布LC-MS分析。A主峰重链去卷积的质谱图（HC），b 各收集后电荷变体中N端糖基化含量分布。白色柱：酸性变体（AP）、斜线柱：主峰（MP）、黑柱：碱性变体（BP）

　　图320种不同单抗产物中，线F含量和酸性电荷变体含量，b G0F含量和碱性电荷变体含量，c G1F含量和酸性电荷变体含量；

　　图 4a 半乳糖基化含量（GI）和b 岩藻糖基化含量（FI）在CEX各组分中的分布。c 初始抗体（startingmaterials）、收集后完整酸性变体（control）和使用β1,4半乳糖苷酶降解后酸性抗体（digest with B 1-4 galactosidase）的CEX图谱。误差线为三个独立实验的标准方差。**p 0.01表明与主峰相比有显著差异（student’st 检验，n=3）

　　表2采用非还原性CE-SDS色谱检测的CEX各组分中L，HHL和完整抗体的分布。误差为三个独立实验的标准方差。

　　表3纯化后的CEX各组分内的抗体片段，聚体和单体分布。误差为三个独立实验的标准方差。

　　随着G0F含量的升高，酸性变体含量递减而碱性变体含量递增，除此之外，酸性变体含量随G1F增加而增加；分离后的酸性变体内，半乳糖基化水平显著升高，但降低半乳糖基化水平并不会改变酸性变体含量。

　　酸性变体和碱性变体内L和HHL含量相较于主峰显著升高，因此二硫键错配可能是导致酸性变体形成的原因之一。

　　酸性电荷变体与主峰对FcRn相似的结合力表明本IgG1型单抗的药代动力学性质和半衰期未受到酸性电荷变体的影响。

　　众所周知，抗体酸性电荷变体是由多种翻译后修饰和化学降解产生，通常不止一种修饰可以引起单抗中酸性电荷变体的形成。本文研究的IgG1单抗酸性变体酸性电荷变体的形成原因包括：二硫键还原，HC-T8 Asn84和HC-T35 Asn388脱酰胺化，以及抗体聚体化和片段化。因此，基于本文深入探究酸性变体来源的基础上，有助于指导我们从质量源于设计的角度进一步解决产物生产过程中的电荷异质性问题。