中国医药生物技术2014 年 lO 月第 9卷第 5 期 ChinMed Biotechnol， October2014， Vo1 ． 9， No． 5 385 DOI： 10． 3969／ cmba． j ． issn． 1673-713X ． 2014． 05． 014 单克隆抗体电荷异构体分离方法优化 程洪杰，马珂 ，秦国宏 ，张道平，张技，王曼 单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白， 常呈现微观不均一 性 ，即 “ 异质性 ”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构 体⋯。这些异构体可能来 自于抗体分子复杂的生物合成途 径，如细胞系及培养工艺I 2】 ，也可能来 自于纯化、制剂等制 造过程以及贮存过程的任何阶段【 1 ]。 其中由于抗体分子所带 电荷差异造成的异质性称为电荷异构体， 一般分为...

　　中国医药生物技术2014 年 lO 月第 9卷第 5 期 ChinMed Biotechnol， October2014， Vo1 ． 9， No． 5 385 DOI： 10． 3969／ cmba． j ． issn． 1673-713X ． 2014． 05． 014 单克隆抗体电荷异构体分离方法优化 程洪杰，马珂 ，秦国宏 ，张道平，张技，王曼 单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白， 常呈现微观不均一 性 ，即 “ 异质性 ”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构 体⋯。这些异构体可能来 自于抗体分子复杂的生物合成途 径，如细胞系及培养工艺I 2】 ，也可能来 自于纯化、制剂等制 造过程以及贮存过程的任何阶段【 1 ]。 其中由于抗体分子所带 电荷差异造成的异质性称为电荷异构体， 一般分为酸性异构 体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。电荷异 构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带； 离子交换色谱图主峰前后出现小峰。 由于这些异构体可能会 影响抗体 的稳定性 、药效 、免疫 原性或药代动 力学，特征性 地识别和分离电荷异构体是至关重要的。 基因泰克公司曾对 上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、 药代 等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超 过一个 pH 单位时 ，会影 响药物 的组织 分布 及药代动力学； ②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除； ③降低正电荷， 会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清 。 因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关 键的挑战， 尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构 体 含量与原研药保持一致 。 在 众多分离手段 中， 离 子交 换层 析被 认为是最有前景的 方法 l4]。有研究表 明， 依赖 pH 变化 的分离方式 比依赖离子 强度变化的分离方式效果更好【 5 ]。近年来不断有研究者通 过 pH 梯度洗脱方式分离电荷异构体。Pabst 等[7 J通过控制 缓冲液中 Tris、双 Tris 丙烷、组氨酸、乙醇胺的比例，而 FaPG电子官方网man 和 M oreno[8]通过调节缓冲液中哌嗪、咪唑和 Tris 的比例 ，均实现了 pH 梯度洗脱，成功分离出抗体的电荷 异构体 ，但整个 工艺较为复杂 ，pH 控制 不稳 定。近些年， 置换色谱凭借其出色的分离能PG电子官方网力， 已成功被应用于分离抗体 电荷异构体 、寡糖 、多肽、小分子化合物 。但商 品化 的阳离 子层析置换剂 Sachem Expell SP1 成本较高， 且伴 随着碱性 异构体的洗脱过程亦有部分置换剂被洗脱【 9]， 也带来一定的 安全隐患，此外，置换序列的监测是一项耗时、难度较大的 工作 ，这些均阻碍其应用 到生产 中。 本课题组经 CHO 细胞表达，Protein A 亲和层析、 SP F F 阳离子层析 已制备纯度达 95％ 以上的单克隆抗体 IgG1， 但阳离子层析动态载量较小且洗脱样品酸性异构体含 量偏高 ( 20％)，不符合质控标准 ( 18％) 。本研究通过 层析介质筛选得到动态结合载量高、分辨率好的层析介质 。 依据 酸性异构体 pI ( 7． 23) 小于 目的组分 pI ( 7． 34) ，参考 pH 梯度洗脱的原理，在原工艺上增加一步预洗步骤，特异 性去除酸性异构体，从而降低最终样品的酸性异构体含量。 技 术 与 方 法 11． 11． 1． 1 纯化，低 pH 值孵育，并用 Tris 中和至 pH 5． 8，浓度约 9． 13 mg／ ml。经毛细管等电聚焦电泳测定，酸性异构体 pI = 7． 23，目的组分 pI = 7． 34，碱性异构体 pI = 7． 47。 1． 1． 2层析柱Poros X S 购 自美 国 Thermo F isher Scientif i c 公司 ：Nuvia S 购 白美 国 Bio R ad 公司；HiT rap SP． FF 购 自美 国 GE health 公司； Eshmuno S 、 Fractoge1 ． E MD 材料与方法 材料 单克隆抗体溶液CHO 细胞发酵液经 Protein A SO3-(M)、Fractogel SE Hicap(M) 均购 自德 国 Merck 公司； HPLC SE C 为美国 Sepax． technologies 公司产 品， 保护柱为 Zenix SEC． 300，50 mm × 7． 8 mm，粒径 3 m；分析柱为 300 mm × 7． 8mm ， 粒径 3 p ,m； HPL C． IEC 为美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品，分析柱为 Propac WCX ． 10， 2 50 1 Tlnl × 4 m m 。 1． 1． 3Na2 HPO412H2O、NaCI、HC1 等为国产分析纯试剂；纯水 由美 国 Bamstead 公司超 纯水 仪制 备。 1． 1． 4 仪 器 AK TA purif i er 蛋 白 纯 化 仪 为 美 国试剂Tris 购 自美国 Amresco 公司； Nai l 2PO4 H20 、 GE Healthcare 公司生产 ，检 测波长为 280 nrn；pH 计为瑞 士 MettlerToledo 公司产品；A gilent1260 型高效液相色谱仪为 美国 A gilent 公司产品；Genesys 10UV 紫外可见分光光度 仪为美国 Thermo Fisher Scientific 公司产品； 台式高速离心 机为德 国 E ppendorf 公 司产 品。 1． 2方法 1． 2． 1上样缓冲液平衡层 析柱 ， 取 ProteinA 亲和后样 品， 20mmol／ L 介 质动态载量测定以 20 mmol／ L PB (pH 5． 8) 为 PB (pH 5． 8) 稀释至 2 mg／ ml ，先流经旁路使紫外 吸收值达 到平台期后， 样品进入层析柱，以穿透样品紫外吸收值达到 平台期 的 10％ 计算动态结合载量 (DBC )。流速与各层析 柱体积匹配 ，使保 留时间为 1 min。 D B C( mg／ m1) =( V A × C o ) ／ v c v A 表示穿透样品紫外吸收值为平台期的 10％ 的上样 体积；C。表示样品蛋白浓度；v 表示总的柱床体积。 1． 2． 2各介质分 辨率 的考 察取 亲和样 品用 20 mmol／ L 作者单位：210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院 (程洪杰、 王曼) ： 210042 南京，江苏先声药业有限公司 (程洪杰、马珂、秦国宏、 张道平、张驶) 通讯作者： 王昱， Email．． minwang@cpu． edu． cn；张驶， Email： zhangtao@ simcere． c om 收稿 日期：2014 03． 05