泌乳和乳腺退化重塑是复杂的生物学过程，需要数千个基因的协调表达。比较泌乳和干奶山羊的差异表达分析揭示了乳腺中蛋白质编码和非编码RNA表达的广泛变化。在此，研究人员假设泌乳和乳腺退化/重塑也可能涉及外显子组成和功能特性不同的转录本丰度的变化。为验证这一假设，研究

　　泌乳和乳腺退化重塑是复杂的生物学过程，需要数千个基因的协调表达。比较泌乳和干奶山羊的差异表达分析揭示了乳腺中蛋白质编码和非编码RNA表达的广泛变化。在此，研究人员假设泌乳和乳腺退化/重塑也可能涉及外显子组成和功能特性不同的转录本丰度的变化。为验证这一假设，研究人员利用基于短读长Illumina和长读长Nanopore测序数据整合的杂交方法，分析了5只泌乳山羊和4只干奶山羊的乳腺转录组。数据过滤后，研究人员在山羊乳腺中检测到来自12,300个基因的21,598个转录本（约每基因座1.7个转录本）。其中，研究人员发现14,092个注释异构体、6,291个新异构体和1,215个新基因座。约39.3%的表达基因产生多个转录本变体。总体而言，山羊乳腺转录组显示外显子跳跃是最常见的剪接事件，其次是初始外显子替代使用、内含子保留以及3′和5′剪接位点变异。研究人员还观察到，有限数量的异构体占据了泌乳乳腺总表达输出的很大一部分，前10个和前50个基因分别占总表达量的约66%和82%。这种转录组特化主要由编码酪蛋白（CSN1S1、CSN2和CSN3）以及主要乳清蛋白如孕激素相关子宫内膜蛋白（PAEP）、α-乳白蛋白（LALBA）和乳脂蛋白（GLYCAM1）的基因驱动，这些是必需的乳营养素。最后，差异转录本使用（DTU）分析比较泌乳和干奶山羊，揭示了443个异构体转换，影响355个独特基因和563个转录本。此外，在泌乳山羊中分别有266个和297个转录本上调和下调，并且预测有413个DTU，影响248个基因，具有功能后果。在这些功能后果中，最重要的是蛋白质结构域获得、非参考结构域异构体获得、无义介导的不敏感性和编码转录本。几个显示DTU的基因在泌乳中具有重要作用，特别相关的是编码表皮生长因子受体（EGFR）、线-磷酸酰基转移酶（GPAM）、羟基类固醇11-β脱氢酶1（HSD11B1）、胰岛素受体底物1（IRS1）、核受体亚家族3组C成员1（NR3C1）和磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1（PIK3R1）的基因。此外，研究人员还检测到几个整合在丝裂原活化蛋白激酶和Rho GTP酶通路中的基因的DTU。总之，研究人员提供了山羊乳腺中表达的RNA异构体的全面目录，并证明泌乳和干奶山羊的乳腺转录本剪接模式存在显著差异。

　　**论文解读：杂交转录组测序揭示山羊泌乳中期与干奶期转录本使用的广泛变化**

　　泌乳和乳腺退化重塑是复杂的生物学过程，涉及数千个基因的协调表达。先前的研究通过差异表达分析比较泌乳和干奶山羊，已揭示乳腺中蛋白质编码和非编码RNA（核糖核酸）表达的广泛变化。然而，对于转录本异构体丰度的变化（即同一基因产生的不同剪接变体的相对表达水平）所知甚少。转录本异构体可通过可变启动子、多聚腺苷酸化位点选择以及可变剪接（alternative splicing，即单个前体mRNA（信使RNA）以不同方式剪接产生多种mRNA异构体的过程）产生。差异转录本使用（DTU）指不同条件下同一基因多个转录本的相对表达变化，可能对细胞功能产生重要生物学后果。例如，山羊αS1-酪蛋白（CSN1S1）基因的F等位基因因剪接位点识别序列顺式调控突变，导致外显子9、10、11跳跃，产生异常转录本，显著降低乳中酪蛋白含量并影响流变学特性。短读长测序（如Illumina）覆盖深度高、碱基准确，但重构异构体困难；长读长测序（如Nanopore）可捕获完整转录本结构，但错误率较高。因此，结合两种技术可弥补局限，实现更全面的转录组重构。本研究假设泌乳和乳腺退化重塑涉及山羊乳腺转录本剪接模式的显著变化，旨在通过杂交测序方法构建转录本异构体目录，并检测DTU。

　　研究人员开展此项研究，旨在探究泌乳中期和干奶期山羊乳腺中转录本使用的差异，从而揭示泌乳和乳腺退化重塑过程中，除了基因表达量变化外，是否还存在转录本异构体丰度的系统性转变。该研究发表在《Journal of Dairy Science》，其意义在于提供了山羊乳腺RNA异构体的全面目录，并证明哺乳动物乳腺在泌乳和干奶期之间存在广泛的转录本剪接模式差异，这有助于理解乳腺生理适应不同生产阶段的分子机制。

　　研究人员从5只Murciano-Granadina山羊（西班牙品种）在泌乳中期（118天）和干奶期（299天）进行乳腺活检，获取组织样本。主要技术方法包括：1）总RNA提取后，分别构建短读长Illumina文库（paired-end 2×100 bp）和长读长Nanopore文库（PromethION平台）；2）使用StringTie2软件以混合模式整合短读长和长读长数据，进行转录组组装和定量；3）通过Gffcompare软件将组装转录本与参考注释比较，分类为注释转录本、新转录本和新基因座；4）利用IsoformSwitchAnalyzeR软件进行差异转录本使用（DTU）分析，基于DEXSeq的负二项广义线性模型，以q-value0.1为显著性阈值；5）使用Pfam、SignalP、CPC2等工具预测蛋白结构域、信号肽、编码潜力及无义介导的mRNA降解（NMD）敏感性，评估功能后果。

　　通过数据过滤，杂交组装获得21,598个转录本，来自12,300个基因（平均每基因1.7个转录本），其中14,092个（65.2%）为注释转录本，6,291个（29.1%）为来自已知基因的新转录本，1,215个（5.6%）为新基因座。约39.3%的表达基因产生多个转录本变体，仅0.8%产生7个及以上转录本。注释转录本平均含10.7个外显子，新转录本8.6个，新基因座仅2.2个。新基因座转录本平均长度1,605 bp，89.8%被预测为非编码。主成分分析显示样本按泌乳/干奶状态聚类。在泌乳期，前10个和前50个表达基因分别占总表达量的约66%和82%，而在干奶期降至约19%和32%。最常见的剪接事件为外显子跳跃（27.7%），其次为初始外显子替代使用（22.8%）、内含子保留（16.3%）、3′和5′剪接位点变异（14.1%和12.9%）。

　　在主要乳蛋白基因中，CSN1S1基因检测到2个异构体：一个注释的蛋白质编码异构体（XM_018049132.1）和一个预测为非编码的新异构体（MSTRG.4338.23），后者缺乏酪蛋白结构域。泌乳期中注释异构体占总表达61.09%。CSN1S2基因检测到6个异构体（2个注释，4个新），其中新异构体MSTRG.4345.6在泌乳期最丰富（28.65%），而干奶期中新异构体MSTRG.4345.11占主导（46.55%），该异构体被预测为NMD敏感。CSN2基因检测到6个异构体（1个注释，5个新），泌乳期中新异构体MSTRG.4341.1最丰富（45.62%），干奶期中注释异构体XM_005681721.2为主（55.32%）。CSN3基因仅检测到一个注释的蛋白质编码异构体。

　　DTU分析共鉴定443个异构体转换，影响355个基因和563个转录本。在泌乳山羊中，266个转录本上调，297个转录本下调。413个DTU（影响248个基因）被预测具有功能后果，主要包括蛋白质结构域获得、非参考结构域异构体获得、无义介导的不敏感性（NMD insensitivity）和编码转录PG电子官方网本变化。与泌乳相关的关键基因包括：表皮生长因子受体（EGFR）基因，其注释XM_018067044.1异构体在泌乳期上调（dIF=0.35），新MSTRG.13873.4异构体下调（dIF=-0.35），后者因内含子保留失去编码潜力。线-磷酸酰基转移酶（GPAM）基因，XM_018041419.1在泌乳期下调（dIF=-0.70），新MSTRG.15923.7上调（dIF=0.27），后者被预测为NMD敏感。羟基类固醇11-β脱氢酶1（HSD11B1）基因，XM_018060777.1下调（dIF=-0.26），XM_005691043.3上调（dIF=0.30），后者缺失adh_short结构域。胰岛素受体底物1（IRS1）基因的XM_018058864.1异构体在泌乳期上调（dIF=0.37）。核受体亚家族3组C成员1（NR3C1）基因，新MSTRG.4771.1下调（dIF=-0.55），注释XM_018050199.1上调（dIF=0.49）。磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1（PIK3R1）基因的XM_005694609.3异构体在泌乳期下调（dIF=-0.55），丢失RhoGAP结构域。此外，MAPK通路（MAP2K4、MAPK3、MAPK6、MAPK13）和Rho GTPase通路（RHOB、RHOC）的多个基因也显示DTU，其中泌乳期上调的MAPK3、MAPK6、MAPK13异构体主要为蛋白质编码并保留功能结构域，而RHOB的注释异构体上调（dIF=0.28），RHOC的注释异构体下调（dIF=-0.46）。功能富集分析显示，DTU基因在分子功能上富集于结合（GO:0005488）和蛋白质结合（GO:0005515），在生物学过程上富集于大分子代谢过程调控（GO:0060255），在细胞组分上富集于膜结合细胞器（GO:0043227）。Reactome通路分析富集到RHOU GTPase循环、信号传导至ERKs和致癌MAPK信号。

　　讨论部分指出，可变剪接在山羊乳腺中普遍存在，本研究通过杂交测序方法构建了21,598个转录本目录，证实约三分之一转录本为新发现，表明山羊转录组注释尚不完善。大多数转录本在泌乳和干奶期无偏表达，但少数基因（如CSN1S1、CSN1S2、PAEP等）表现出条件特异性。泌乳期乳腺中有限基因（如酪蛋白和乳清蛋白基因）主导总表达，这与泌乳期高代谢需求一致。在酪蛋白基因中，检测到多种异构体，如CSN1S2的6个异构体，其中新异构体在泌乳期占主导，而干奶期一个NMD敏感异构体占优势。DTU分析显示，泌乳期上调的异构体倾向于具有蛋白质结构域获得和编码潜力，且对NMD不敏感，这反映了泌乳期乳腺对氨基酸和蛋白质合成的高需求，以及内质网应激可能抑制NMD。关键基因如EGFR、GPAM、HSD11B1、IRS1、NR3C1、PIK3R1的DTU与乳腺发育、脂质代谢、糖皮质激素信号和PI3K/Akt通路相关。MAPK和Rho GTPase通路中的异构体转换可能调制乳腺上皮细胞增殖、分化和重塑。结论部分翻译如下：通过使用杂交测序方法，研究人员构建了来自12,300个基因的21,598个异构体的目录，这些异构体在泌乳和干奶山羊的乳腺中表达。其中约三分之一的转录本是来自注释基因的新异构体或来自新非注释基因的新基因座，表明山羊转录组注释仍远未完成。研究结果证明，泌乳中期和乳腺退化重塑不仅涉及基因表达的变化，还涉及结构、外显子组成和功能特性不同的转录本相对丰度的改变。