综述：Temporin A–L 肽的化学优化：从天然异构体到增强抗菌类似物

　　Temporin A–L（Temporins A–L）是一类从欧洲林蛙（Rana temporaria）皮肤分泌物中分离的短链抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs），已成为开发新型抗感染药物的有前景的支架。然而，其治疗转化受到选择性适中、易受蛋白酶降解以及效力可变等问题的限制。在本综述中，研究人员提供了致力于通过系统性化学修饰优化这类AMP的药物化学工作的概述。讨论了包括骨架修饰（如D-氨基酸掺入和逆反设计）、侧链调节、电荷调控、疏水性调整以及非经典残基引入等策略，及其对抗菌活性和选择性的影响。特别关注了构象受限的类似物，如环状、钉合和双环衍生物，这些通常表现出增强的稳定性和生物活性。通过整合现有数据，研究人员描绘了控制temporin功能的关键结构-活性关系（structure-activity relationships, SAR），并确定了开发改进类似物的新兴设计原则。最后，概述了当前挑战和基于temporin的治疗药物在药物化学中的未来前景。

　　细菌感染发病率的上升，以及现有抗生素的过度和不当使用，加速了细菌耐受性和耐药性的出现。世界卫生组织（WHO）将抗菌药物耐药性列为“全球公共卫生和发展的最大威胁之一”。尽管耐药菌株持续增加，但真正创新的抗菌药物开发仍有限。抗菌肽（antimicrobial peptides, AMPs）作为先天免疫的关键成分，具有广谱活性和较低的耐药诱导倾向，主要通过破坏细菌膜发挥作用，也可能涉及免疫调节和细胞内机制。然而，仅少数肽类抗感染药物（如达托霉素、万古霉素）进入临床，大多数AMP面临蛋白水解稳定性差和细胞毒性等问题。temporin肽，特别是temporin A–L家族，为探索结构-活性关系（structure-activity relationships, SAR）和开发优化AMP治疗药物提供了有价值模型。

　　Temporins是一类短链、合成成本低、广谱抗菌的肽，具有高疏水残基含量和两亲性α-螺旋构象。Temporin A–L从欧洲林蛙皮肤分泌物中分离，通常由10或13个氨基酸组成，在中性pH下净正电荷较低（0至+3），对细菌、真菌、病毒和原生动物有活性，但D和H异构体在标准条件下几乎无活性。其作用机制主要涉及细胞膜扰动，活性依赖于构象适应性。Temporin A（TA）为13肽（FLPLIGRVLSGIL-NH2，净电荷+2），对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌MIC 2.6–5.2 μM）和革兰氏阴性菌（如大肠杆菌MIC 11.9 μM）有活性，通过地毯样机制破坏膜。Temporin B（TB）为13肽（LLPIVGNLLKSLL-NH2，净电荷+2），主要抗革兰氏阳性菌，对革兰氏阴性菌活性有限。Temporin F（TF）为13肽（FLPLIGKVLSGIL-NH2，净电荷+2），对大肠杆菌有活性且低溶血。Temporin L（TL）为13肽（FVQWFSKFLGRIL-NH2，净电荷+3），是家族中最强效成员，广谱抗菌，包括铜绿假单胞菌（MIC 24–48 μM）和大肠杆菌（MIC 6–12 μM），具有抗生物膜和抗病毒活性，通过瞬时孔形成破坏膜，并在大肠杆菌中与细胞分裂蛋白FtsZ相互作用。但TL具有显著溶血性和细胞毒性。其他异构体（C、E、K）活性中等，D和H基本无活性。

　　优化主要集中在TA、TB、TL和TF上，通过系统性化学修饰鉴定SAR趋势。

　　TA的逆序类似物（Rev-TA）活性显著降低，归因于螺旋偶极扰动；全D类似物（D-TA）活性与TA相当，且抗蛋白酶降解能力增强，提示活性主要非手性；交替L,D模式（L,D-TA）活性降低，因破坏螺旋结构。TB中引入D-Lys（TB_kkG6k）保留活性。TL中，逆反类似物（RI-TL）活性降低，而全D类似物（D-TL）活性保留。在TL的[Pro3]类似物上进行D-扫描，[Pro3,D-Leu9]TL（7）保留抗菌活性且溶血显著降低，Leu9为关键立体化学热点；而其他位置（如Lys7、Phe8等）的D-取代导致活性降低。位置10（Gly10）的D-取代（如D-Nle、D-Lys、D-Trp）显示较好耐受性，[Pro3,D-LPG电子ys10]TL（14）活性增强。

　　TA的丙氨酸扫描显示Phe1、Ile5、Ile12为疏水核心，替换后活性丧失；Arg7替换为Lys或带正电荷残基时活性降低，且侧链缩短可降低溶血；N-乙酰化（AcTA）提高活性，C-末端去酰胺化（TAc）活性丧失；二聚化（TAd）增强活性但增加溶血。TB中，Pro3、Asn7、Ser11可被替换，Gly6替换为Ala（TB_G6A）显著增强活性；N-末端引入阳离子残基（如TB_KKG6A）扩大抗菌谱并降低溶血；位置6替换为Lys（TB_KKG6K）产生高效类似物。TF中，Lys取代（如G6K-TF）提高活性且不溶血。TL中，Phe5和Phe8的丙氨酸替换（F5A-TL、F8A-TL）降低活性但减少细胞毒性；Gln3替换为Lys（Q3K-TL）提高活性并降低溶血；Arg11替换为Lys或Orn降低活性；[Pro3,D-Lys10]TL（61）活性增强；增加净电荷（如TL-2）可提高活性但常牺牲选择性。

　　TA中，Phe1替换为Trp（W1-TA）增强抗MRSA活性；4-氟苯丙氨酸替换（DT4F）提高抗革兰氏阴性菌活性但增加细胞毒性；Ile5和Ile12替换为Leu（L5,12-TA）增强活性。TB中，Gly6替换为Ile或Val中等程度提高活性；Leu1替换为Phe配合C-末端引入Lys（TB_L1FK）扩大抗菌谱；位置6的短链酰化（如Ac、DAVA、Ahx、BrHx、Aund）提高活性，长链则降低活性。TL中，Phe5和Phe8替换为Leu（F5L-TL、F8L-TL）提高抗内毒素活性并降低溶血；Phe1替换为Nle（[Nle1,Pro3,D-Leu9,D-Lys10]TL）提高抗革兰氏阴性菌活性；Val2替换为Leu（TLP-1）增强SARS-CoV-2 Mpro抑制；引入Pro3破坏螺旋但保留活性，而双Pro替换（Pro3,Pro10）活性丧失；位置3的氟代或芳香取代降低活性；位置10替换为Leu导致活性丧失和溶血增加；β-亮氨酸替换保留活性但丧失螺旋；[Pro3,Nle10]TL和[Pro3,Trp10]TL活性增强；脂化策略中，C8-C14短链脂肪酸提供最佳抗菌活性，N-末端或Phe1对位脂化影响不同。

　　TA中，Phe1替换为Tyr（DTTyr1）活性降低；Pro3替换为Gly或Gln保留活性；Ser10替换为Thr保留活性，替换为Tyr活性降低；序列重排类似物（6–1)(7–13)TA活性中等降低。TL中，Gly10替换为D-羟基脯氨酸（[Pro3,D-Hyp10]TL）降低活性并丧失α-螺旋；乱序类似物（TempL SCR-1、SCR-2）活性降低，证实序列顺序对功能重要。

　　综合结果表明，temporin活性由骨架立体化学、疏水性、电荷分布和残基定位的精细平衡决定。全D-类似物耐受，但局部立体化学破坏影响活性；电荷优化需考虑空间分布而非绝对电荷；疏水性的适度增加可增强活性，但过度则导致聚集和毒性；关键疏水核心残基不容替换，而耐受位点可用于优化；乱序和引入非经典残基进一步强调序列顺序的重要性。设计原则包括：保持两亲性结构、保留关键锚定残基、在最优范围内调节疏水性、控制关键位点立体化学、考虑序列顺序和构象适应性。

　　基于[Pro3,D-Leu9]TL（7）引入内酰胺桥，i,i+4环化（如Lys6-Glu10，肽139）保留两亲性α-螺旋，增强抗革兰氏阳性菌活性（MIC 3.12 μM）并具有抗真菌和抗生物膜活性；立体反转（Glu10D，肽143）保留活性；结合胍基引入（肽144-151）增强抗革兰氏阴性菌活性；i,i+7环化（肽152-153）活性显著降低。

　　三氮唑桥接类似物（i,i+4或i,i+7）保留抗革兰氏阳性菌活性，但抗革兰氏阴性菌活性降低；二硫键和烃桥类似物（肽161-162）活性降低。烃钉合中，中央区域（eTL5-9，肽164）保留或增强抗菌活性并低溶血，而N-和C-末端钉合增加细胞毒性；胍基桥（肽166-168）同时增强阳离子性和环化，提高抗革兰氏阴性菌活性（如MIC 1.56 μM抗鲍曼不动杆菌）并改善蛋白水解稳定性。

　　基于TLP-1和TLP-2，引入三个半胱氨酸经TBMB或TATA连接子形成双环，提高SARS-CoV-2 Mpro抑制活性（IC506–12 μM），TBMB连接的TLP-2衍生物（肽171）活性最高，分子动力学模拟支持构象刚性和增强的酶-肽相互作用。

　　本综述系统分析了temporin A–L的化学修饰，归纳出SAR原则：抗菌活性由立体化学、疏水性、电荷分布和构象组织的平衡决定。当前研究存在局限性，如抗菌活性报告单位不统一（μM与μg/mL）、细胞毒性方法差异、抗菌谱评估不一致等。肽优化还应考虑与抗生素协同使用及递送系统。未来需标准化实验条件、扩大生物活性评估（包括抗真菌、抗炎）和体内验证，以推动temporin衍生抗菌剂的开发。